W pracy przedstawiono wpływ modyfikacji zaolejonej ziemi bielącej – ZZB (odpadu przemysłu tłuszczowego) dodatkami mineralnymi i/lub biologicznymi na zmiany ilościowe i jakościowe mikroflory oraz kierunek przemian tłuszczu. Przeprowadzone badania wykazały, że mikroorganizmy autochtoniczne, w tym również bakterie, nie tylko rozwijają się, ale wykazują aktywność lipolityczną w kwaśnym środowisku ZZB. W następstwie ich działalności następuje przekształcenie kwasu oleinowego (głównego składnika ZZB) w procesie biokonwersji, której mechanizm i tempo zależą od typu modyfikacji tego odpadu. W procesie samorzutnej biokonwersji w największej ilości powstają kwasy nasycone, natomiast modyfikacje prowadzą do wzrostu koncentracji aldehydów i węglowodorów. Problem zagospodarowania ZZB związany jest nie tyle z obniżeniem zawartości kwasu oleinowego oraz skróceniem czasu jego zanikania, co ze składem ilościowym i jakościowym końcowych produktów jego biokonwersji.
Praca jest adresowana jest do zainteresowanych biotechnologią środowiska.

1. Skład fizykochemiczny ZZB determinował występowanie różnych grup drobnoustrojów o zróżnicowanej aktywności lipolitycznej zaadaptowanych do kwaśnego środowiska; najwyższą aktywność wykazywały szczepy należące do gatunków : Bacillus subtilis Bh, Streptomyces sp. Pr1, Staphylococcus warnerii L15, Ochrabactrum anthropi L21, Penicillium citrinum PenA i Penicillium frequestans Pen11. W świeżym odpadzie nie stwierdzono obecności drożdży o aktywności lipolitycznej. ZZB może stanowić potencjalne źródło acydofilnych szczepionek.

2. Liczebność mikroorganizmów w ZZB, bez względu na typ modyfikacji, podległa cyklicznym zmianom, uzależnionym prawdopodobnie od obecności pośrednich produktów biokonwersji kwasu oleinowego (tzn. kwasów nasyconych, aldehydów, węglowodorów i innych), metali zaadsorbowanych w ZZB, a także metabolitów produkowanych przez mikroorganizmy. Odczyn środowiska nie miał w tym przypadku wyraźnego wpływu, chociaż w obecności jonów Ca(II) wahania w liczebności były najniższe.

3. Bioróżnorodność pojawiających się mikroorganizmów w ZZB uzależniona była od sposobu modyfikacji odpadu. Niezależnie od rodzaju bioaugmentacji pojawia się gatunek Acinetobacter lwoffii, biostymulacji – Cladosporium cladosporioides, a bioremediacji - Cladosporium cladosporioides i gatunki z rodzaju Bacillus. Zastosowane szczepionki nie zdominowały zatem środowiska, ale w następstwie ich „działalność” – produkcji metabolitów – uaktywniły się nowe grupy konsorcjum mikrobiologicznego.

4. Procentowy udział mikroorganizmów lipolitycznych w populacji mieszanej zależał od typu modyfikacji ZZB i wzrastał po biostymulacji lub bioagumentacji. Natomiast w procesie bioremediacji zależał od rodzaju szczepionki i dodatków mineralnych – wzrastał przy udziale jonów FE(II) lub Ca(II) i Fe(II) po inokulacji Yarrowia lipolytica A101 i Penicillium citrinum PenA oraz jonów Ca (II) lub Fe(II) po inokulacji Streptomyces sp. Pr1, a w pozostałych przypadkach nie miał wpływu lub obniżał się.

5. Typ modyfikacji wyraźnie oddziaływał także na mikroorganizmy niewykazujące aktywność lipolitycznej. Bioremediacja z udziałem szczepionki Penicillium citrinum PenA stymulowała rozwój drożdży, a biostymulacja jonami Ca(II) i bioremediacja w obecności jonów Ca(II) i FE (II) i szczepionki Yarrowia lipolytica A101 – grzybów strzępkowych. Natomiast bioremediacja w obecności jonów Ca(II) lub Fe(II) z udziałem szczepionki Bacillus subtilis Bh stymulowała rozwój bakterii, a ograniczała rozwój grzybów.

6. Zawartość kwasu oleinowego, głównego składnika odpadu, wykazywała tendencję do znikania. Obserwowano okresowe wyraźne obniżenie koncentracji w 7., 60. i 180. dniu i okresowe powstawanie de novo w pozostałych okresach badawczych, a najefektywniejsze zmiany miały po bioaugmentacji ZZB szczepionkami Penicillium citrinum PenA lub Yarrowia lipolytica A101. W procesie bioremediacji stopień tych przemian był uzależniony od typu dodatków mineralnych i rodzaju szczepionki – synergistyczne działanie wykazywały wszystkie szczepionki w obecności jonów Fe(II), a obecność jonów Ca(II) lub CA(II) i Fe(II) tylko szczepionki Bacillus subtilis Bh i Streptomyces sp. Pr1.

7. Podstawowym procesem przekształcenia kwasu oleinowego w ZZB była biokonwersja, której mechanizm i tempo zależały od typu modyfikacji ZZB, a nie od jej odczynu.

8. Prawdopodobnie sumaryczne mechanizmy procesu biokonwersji kwasu oleinowego są następujące:

• β-oksydacja – po biostymulacji Fe(II) lub Ca(II), po bioaugmentacji szczepionkami: Penicillium citrinum PenA, Yarrowia lipolytica A101 i Streptomyces sp. Pr1 w procesie bioremediacji niezależnie od dodatków mineralnych z udziałem szczepionek eukariontów oraz szczepionki Streptomyces sp. Pr1 w obecności jonów Ca(II),

• rozpad podwójnego wiązania w cząsteczce kwasu oleinowego przy C9 po uprzednim utworzeniu nadtlenków – biokonwersja samorzutna oraz biostymulacja Ca(II) i Fe(II),

• izomeryzacja podwójnego wiązania w cząsteczce kwasu oleinowego i jego rozpad poprzez tworzenie nadtlenków oraz procesy redoks, a także elongacja – po bioaugumentacji Bacillus subtilis Bh, bioremediacji niezależnie od dodatków mineralnych po inokulacji Bacillus subtilis Bh bąź przy udziale jonów Fe(II) oraz Ca (II) i Fe(II) i szczepionki Streptomyces sp. Pr1.

9. Dodatki mineralne lub/i biologiczne zmieniały przebieg procesu biokonwersji kwasu oleinowego w porównaniu z niemodyfikowaną ZZB, a skład produktów końcowych biokonwersji kwasu oleinowego zależał od typu modyfikacji odpadu.

10. W odpadzie niemodyfikowanym powstawały główne kwasy nasycone (20%) oraz niewielkie ilości aldehydów (ok. 1%), co daje możliwość wykorzystania tego odpadu jako naturalnego źródła nasyconych kwasów tłuszczowych, odzyskiwanych w wyniku ekologicznego procesu wymywania gorącą wodą.

11. W obiektach modyfikowanych koncentracja kwasów nasyconych w ZZB uległa obniżeniu w zależności od typu stosowanych zabiegów: w najmniejszym stopniu po biostymulacji, bioaugumentacji Bacillus subtilis Bh oraz bioremediacji z udziałem jonów Fe (II) i szczepionek ( z wyjątkiem drożdżowej), a w największym stopniu (2, 3-krotnie) po bioaugmentacji Yarrowia lipolytica A101 i bioremediacji z udziałem tego szczepu niezaleznie od dodatków mineralnych oraz bioremediacji (niezależnie od szczepionki) z udziałem jonów Ca(II) oraz bioremediacji z udziałem jonów Ca(II) i Fe(II) i szczepionki Streptomyces sp. Pr1.

12. W obiektach modyfikowanych wzrastała koncentracja aldehydów w ZZB od 2,30 do 18%, a węglowodorów od 1,50 do 6,50%. Powstawanie aldehydów w najwyższym stopniu indukowała bioaugmentacja (z wyjątkiem szczepionki Bacillus subtilis Bh), bioremediacja z udziałem jonów Ca(II) i Yarrowia lipolytica A101. Natomiast powstawanie najwyższych ilości węglowodorów generowała bioaugumentacja Bacillus subtilis Bh i bioremediacja z udziałem tej szczepionki (bez względu na obecność dodatków mineralnych).

13. Problem zagospodarowania ZZB jest związany nie tyle z obniżeniem zawartości kwasu oleinowego w odpadzie, co z obecnością w niej produktów jego konwersji: głownie aldehydów, węglowodorów i kwasów nasyconych. Odpad ten nie nadaje się do celów rolniczych, może być jedynie źródłem związków chemicznych wyizolowanych metodami specjalnymi.

14. Zastosowanie szczepionki autochtonicznych mikroorganizmów lipolitycznych, a także szczepu o udokumentowanych właściwościach lipolitycznych (Yarrowia lipolytica A101) zarówno w procesie bioaugumentacji, jak i skojarzone z dodatkami mineralnymi w procesie bioremediacji ZZB prowadziły do zmian stosunków biotycznych w odpadzie i modelowały bionkonwersję kwasu oleinowego w środowisku kwaśnym.

15. Przeprowadzone badania udowodniły, że mikroorganizmy autochtoniczne nie tylko rozwijają się, ale i wykazują aktywność lipolityczną w kwaśnym środowisku ZZB.

Spis treści

1. Wstęp

   1. Wprowadzenie

   2. Charakterystyka ziemi bielącej (ZB)

   3. Charakterystyka zaolejonej ziemi bielącej (ZZB) jako odpadu przemysłu tłuszczowego i sposoby jej zagospodarowania

   4. Lipazy mikrobiologiczne jako biokatalizatory

2. Geneza i cel pracy

3. Materiał i metody badań

   1. Materiał badawczy

   2. Schemat doświadczenia

   3. Metody mikrobiologiczne

      1. Oznaczanie ogólnej liczby drobnoustrojów

      2. Izolacja i identyfikacja izolatów

      3. Skrining szczepów o aktywności lipolitycznej

   4. Analizy chemiczne

   5. Analiza statystyczna wyników badań

4. Wyniki badań

   1. Charakterystyka fizykochemiczna i mikrobiologiczna ZZB

      1. Skład chemiczny ZZB i ekstraktów tłuszczowych

      2. Mikroflora autochtoniczna w ZZB

      3. Skrining szczepów o aktywności lipolitycznej

   2. Biostymulacja mikroflory i przemian tłuszczu w ZZB

      1. Dynamika zmian liczby i składu mikroorganizmów

      2. Przemiany tłuszczu

      3. Prognozowane tempo zanikania kwasu oleinowego

   3. Bioaugmentacja ZZB

      1. Dynamika zmian liczby i składu mikroorganizmów

      2. Przemiany tłuszczu

      3. Prognozowane tempo zanikania kwasu oleinowego

   4. Bioremendiacja ZZB

      1. Dynamika zmian liczby i składu mikroorganizmów

      2. Przemiany tłuszczu

      3. Prognozowane tempo zanikania kwasu oleinowego